5月29日,生命科学亚博取款高效快速刘亮教授课题组在Nature biotechnology在线发表了题为“Trans-nuclease activity of Cas9 activated by DNA or RNA target binding”的研究论文,首次揭示了tracrRNA(trans-activating crRNA)与crRNA结合形成的gRNA(guide RNA)引导的Cas9在特异性地识别目标DNA或RNA分子后对非目标核酸分子(可以是DNA或RNA)展现出高效的反式切割活性。根据该特性,刘亮团队开发了基于Cas9反式切割活性的新型核酸检测平台,实现了对多种病毒和肿瘤耐药性突变的高灵敏度和特异性的检测。
基于CRISPR-Cas系统新型核酸酶活性的挖掘,是基因操作工具开发的基础。Cas9作为基因编辑领域的明星蛋白,属于II型CRISPR-Cas系统效应蛋白,其可在guide RNA的引导下对目标双链DNA实现特异性地顺式切割,是目前最常使用的基因编辑工具。Cas9作为多核酸酶结构域的蛋白,可能有潜在的新核酸酶活性尚未被挖掘。
团队成员在研究中发现,target DNA激活了Cas9-sgRNA的反式切割活性。但该系统所表现出的反式切割活性较弱,一定程度上影响了Cas9-sgRNA系统在后续核酸检测方面的应用。而后团队成员采用了Cas9-tracrRNA-crRNA系统对Cas9的反式切割活性进行检测。结果表明,在双引导RNA系统(tracrRNA-crRNA)的协助下,Cas9的反式切割活性得到了显著提升:不仅对poly T/C/A分子均展现出了反式切割活性,还可在目标核酸分子存在的情况下对M13噬菌体基因组ssDNA分子实现非特异切割。团队成员进一步获得了Cas9-sgRNA-target RNA三元复合物的晶体结构,通过结构研究揭示了Cas9系统靶向目标RNA的原子基础。
基于Cas9上述新活性,刘亮团队结合核酸扩增技术开发了两款名为DACD(DNA-activated Cas9 Detection)和RACD(RNA-activated Cas9 Detection)的核酸检测工具。采用该检测平台,团队实现了对猴痘病毒、呼吸道合胞病毒的高特异性、高灵敏度的快速检测。同时,Cas9-tracrRNA-crRNA系统在单核苷酸多态性检测中表现出了很强的特异性。在选取的靶序列仅存在单核苷酸差异的情况下,DACD和RACD法均可准确区分来自猴痘病毒刚果毒株和西非毒株的B6R基因。
综上,该研究证实了Cas9存在新的核酸酶活性,并拓展了Cas9除基因编辑工具以外的应用,同时为基因编辑提供了一定的指导作用,将进一步推进CRISPR检测在分子诊断领域的发展。
生命科学亚博取款高效快速刘亮教授为该论文的通讯作者,助理教授陈霁云、2022级博士研究生陈莹、2021级博士研究生黄玲珑为该论文的共同第一作者,博士研究生林晓峰、陈泓、相文文参与了该论文的研究。该研究得到华中农业大学生命科学技术亚博取款高效快速韩文元教授的大力支持,厦门大学生物医学仪器共享平台吴彩明、吴雅颖以及生命科学亚博取款高效快速实验教学中心郑伟、胡进为该研究提供了重要的技术支持。该研究得到了国家自然科学基金、福建省自然科学基金、厦门市自然科学基金、厦门大学高层次人才启动经费等经费的资助。
论文链接:https://www.nature.com/articles/s41587-024-02255-7
(生命科学亚博取款高效快速刘亮教授课题组)